油茶Camellia oleifera是我国特有的木本食用油料树种。由刺盘孢属真菌引起的炭疽病是油茶的主要病害，常引起落花落果，造成巨大经济损失。果生炭疽菌Colletotrichum fructicola是油茶炭疽病的优势流行致病菌。在植物与病原真菌的互作过程中，病菌会遭受宿主植物诱导的内质网压力（ER stress），从而激活非折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR）通路。内质网相关蛋白质降解途径(Endoplasmic reticulum-associated protein degradation, ERAD)，将不能正确折叠的蛋白底物由内质网运输至泛素-蛋白酶体系统进行降解，是缓解内质网压力的重要途径。团队前期在果生炭疽菌中鉴定到bZIP转录因子CfHac1，研究发现其对于内质网应激及致病性具有关键作用。然而，CfHac1在内质网应激中的调控机制仍不清楚。

近期，中南林业科技大学林学院李河教授团队在Stress Biology发表了题为“The transcription factor CfHac1 regulates the degradation of ubiquitin-mediated ER-associated misfolded proteins and pathogenicity in Colletotrichum fructicola”的论文，揭示了果生炭疽菌转录因子CfHac1调控内质网相关错误折叠蛋白降解从而应答内质网压力的分子机制。

果生炭疽菌是油茶炭疽病的优势流行致病菌，其侵染油茶的分子机制尚不明晰。阐明bZIP转录因子CfHac1转录调控果生炭疽菌应答内质网压力和致病力的分子机制，可望挖掘一批参与内质网压力应答相关途径的潜在药靶，为新型杀菌剂的开发提供依据。论文研究分析了CfHAC1基因及其非常规剪切编码蛋白的生物学功能，揭示了转录因子CfHac1调控果生炭疽菌降解内质网相关错误折叠蛋白缓解内质网压力的机制。

CfHAC1基因依赖非常规剪切调控错误折叠蛋白的泛素化降解

研究了完全突变体ΔCfhac1和不能发生非常规剪切菌株ΔCfhac1/CfHAC1^{mut intron}以及持续激活菌株ΔCfhac1/CfHAC1^S3种突变体对错误折叠蛋白CfCpy*-GFP的降解情况。与野生型相比，ΔCfhac1，ΔCfhac1/CfHAC1^{mut intron}和持续激活菌株ΔCfhac1/CfHAC1^S降解CfCpy*-GFP的能力显著下降（图1A, B, C, D, E, F），结果表明CfHAC1基因的非常规剪切对错误折叠蛋白的降解是必需的。进一步研究发现果生炭疽菌野生型菌株中的CfCpy*-GFP能被泛素化，而完全突变体ΔCfhac1和不能发生非常规剪切菌株ΔCfhac1/CfHAC1^{mut intron}及持续激活菌株ΔCfhac1/CfHAC1^S中CfCpy*-GFP泛素化水平显著降低（图1G，H），这可能是突变体中错误折叠蛋白CfCpy*-GFP降解受阻的主要原因。试验结果表明CfHAC1基因通过非常规剪切调控内质网相关错误折叠蛋白的泛素化降解过程。

图1 CfHAC1基因依赖非常规剪切调控错误折叠蛋白的泛素化降解

CfHAC1基因通过非常规剪切调控泛素连接酶基因CfHRD1及CfHRD3基因的表达

对DTT处理下果生炭疽菌突变体ΔCfhac1的转录组进行了研究，发现显著下调表达基因中有32个基因富集在内质网蛋白质加工通路中（Protein processing in ER），其中基因编号A09151和A00730为泛素连接酶相关基因，可能参与泛素-26S蛋白酶体降解途径。综合这两个基因的结构域和系统发育的分析结果，将A09151和A00730基因分别命名为CfHRD1和CfHRD3。qRT-PCR试验结果表明，在DTT处理的野生型菌株中，CfHRD1和CfHRD3基因显著上调表达；而在突变体ΔCfhac1，ΔCfhac1/CfHAC1^{mut intron}以及ΔCfhac1/CfHAC1^S菌株中，无论是否经过DTT处理过，CfHRD1和CfHRD3基因均未上调表达，说明在内质网压力胁迫时CfHRD1和CfHRD3基因的上调表达依赖CfHAC1基因的非常规剪切。

果生炭疽菌E3泛素连接酶基因CfHRD1和CfHRD3基因调控泛素化介导的错误折叠蛋白降解和致病力

对突变体ΔCfhrd1和ΔCfhrd3以及双敲突变体ΔCfhrd1/ΔCfhrd3对错误折叠蛋白CfCpy*-GFP的泛素化和降解情况进行了研究。Western blot试验结果表明，相较于野生型，错误折叠蛋白CfCpy*-GFP在突变体ΔCfhrd1和ΔCfhrd3以及双敲突变体ΔCfhrd1/ΔCfhrd3中的积累显著增多（图2 A，B，C，D），说明CfHRD1和CfHRD3基因参与调控内质网相关错误折叠蛋白的降解过程。进一步研究发现，相较于野生型菌株，突变体ΔCfhrd1、ΔCfhrd3以及双敲突变体ΔCfhrd1/ΔCfhrd3中CfCpy*-GFP泛素化水平显著降低（图2E, F），这可能是突变体中错误折叠蛋白降解受阻的主要原因；致病力测定结果表明， ΔCfhrd1和ΔCfhrd3突变体的致病力显著下降，尤其是双敲突变体ΔCfhrd1/ΔCfhrd3的致病性完全丧失(图2G，H)，表明CfHRD1和CfHRD3基因调控果生炭疽菌的致病过程。

图2 CfHRD1和CfHRD3基因调控泛素化介导的错误折叠蛋白降解和致病过程

总结与展望

当果生炭疽菌受到寄主植物造成的内质网压力时，非常规剪切转录因子CfHac1^S调控E3泛素连接酶基因CfHRD1及CfHRD3基因上调表达，泛素连接酶CfHrd1和CfHrd3泛素化错误折叠蛋白，使其能够被26S蛋白酶体识别并降解，从而缓解错误折叠蛋白积累造成的内质网压力。本研究揭示了果生炭疽菌转录因子CfHac1调控ERAD途径的分子机制，研究结果为以该调控途径关键基因为靶标的新型杀菌剂研发提供理论依据。

作者简介

中南林业科技大学李河教授为该论文的通讯作者，张盛培副教授、博士研究生郭源参与了该研究；博士研究生李司政为论文的第一作者；本工作受到了国家自然科学基金项目的资助。